技術(shù)文章
Kary Mullis博士也許并沒有想到,他發(fā)明的PCR技術(shù)能夠在未來三十年保持長盛不衰。這不僅要歸功于DNA聚合酶的發(fā)展,也要歸功于PCR儀的不斷升級。如今,反應(yīng)效率提高,反應(yīng)體積減少,使得PCR逐漸應(yīng)用在更廣泛的領(lǐng)域。選購PCR儀,似乎并不是一件難事。然而,對于一些關(guān)鍵的參數(shù),你真的了解它們的意義嗎?
快速變溫
現(xiàn)在,快速PCR已成為一種潮流。反應(yīng)時間從90分鐘縮短到30分鐘,是受歡迎的,畢竟誰也不想在預(yù)約PCR儀時排隊等太久。溫度循環(huán)是所有PCR的基礎(chǔ)。儀器的變溫速率將決定PCR運行的整體速度。毫無疑問,變溫越快,PCR運行也越快。宣傳資料往往也會首先展示zui高變溫速率以暗示PCR儀運行速度更快。因此,在拿到參數(shù)表時,我們*時間會留意變溫速率,也就是升降溫速率。
不過,如果大家留心看,通常會發(fā)現(xiàn)ramp rate前面還會有一個Max,這說明制造商公布的是zui大變溫速率。zui大模塊變溫速率(maximum block ramp rate)表示模塊變溫速率的極限峰值。在PCR運行過程中,上述zui大性能只在極短的時間內(nèi)可達到,那種掐著秒表來計算變溫速率的方法是不可取的。因此有誠意的制造商還會公布平均模塊變溫速率(average block ramp rate),表示在較長的變溫范圍內(nèi)溫度變化的速率。這個參數(shù)沒那么炫目,但更具參考意義,具有比較價值。
當(dāng)然,樣品的變溫速率可沒有模塊那么高。這就好比在爐子上燒水,爐子很快就達到100oC以上,但水可能只有50oC。模塊的熱量傳遞到樣品還需要一定的滯后時間。因此,只根據(jù)模塊溫度編程而不考慮樣品體積的變溫速率并不能算準(zhǔn)確。Applied Biosystems在這一點上就很周道,提供了另一種參數(shù),平均樣本變溫速率(average sample ramp rate)或者zui大樣品變溫速率(maximum sample ramp rate)。這個參數(shù)能反應(yīng)儀器根據(jù)體積來控制樣品達到設(shè)置溫度、遵循預(yù)設(shè)的實驗方案運行的真實能力,更有效地評估PCR儀的真實性能。
以Applied Biosystems ProFlex? PCR系統(tǒng)為例,96孔和全新3x32孔模塊的zui大變溫速率達到6.0oC/秒,而標(biāo)示樣品的zui大變溫速率也達到4.4oC/秒(1 μl樣品體積)。配合快速PCR試劑,擴增500 bp的片段,不到半小時即可完成。它采用溫度控制算法將樣本體積及反應(yīng)管的厚度考慮在內(nèi),其實際模塊溫度高于設(shè)置點,從而使滯后的樣本溫度能夠更快地達到設(shè)置點(又稱為模塊熱過沖)。算法要才可根據(jù)不同體積使樣本達到穩(wěn)定的設(shè)置點溫度且無過沖及相關(guān)的負面效應(yīng)。
溫控準(zhǔn)確
對于PCR反應(yīng)而言,zui重要的莫過于溫度控制的準(zhǔn)確性。由于PCR是一個幾何級數(shù)擴增的過程,不論是變性、退火還是延伸都需要準(zhǔn)確控制溫度,對退火而言溫控顯得尤為重要。有時,退火溫度相差1oC,就能帶來迥然不同的結(jié)果。目前,市場上的大多數(shù)PCR儀采用Peliter元件加熱,溫度準(zhǔn)確性在±0.2oC左右。
溫度控制算法的性無疑會影響溫度控制的。前面提到的模塊熱過沖,需要非常豐富的經(jīng)驗,的算法才可使不同體積的樣本達到穩(wěn)定的設(shè)置點溫度且無過沖及相關(guān)的負面效應(yīng)。
對于96孔板PCR儀來說,另一個重要的參數(shù)是溫度均一性,這指的是各孔之間的溫度差異。均勻擴增反應(yīng)板各孔的能力至關(guān)重要,在實驗設(shè)計時常常被忽略。如果孔間的溫度條件不一致,那么我們自然無法通過比較兩個不同位置的反應(yīng)孔數(shù)據(jù),而得到可靠的結(jié)論。大多數(shù)儀器的溫度均一性在±0.3到±0.5oC之間。比如,Eppendorf的Mastercycler Pro S,在20-72oC時,均一性≤ ±0.3oC,在95oC,均一性≤ ±0.4oC。
對于梯度PCR而言,溫度準(zhǔn)確性的要求似乎更高。梯度PCR儀zui先由Eppendorf公司在1998年研發(fā)成功推向市場(Mastercycler Gradient)。通過設(shè)置一系列的梯度退火溫度進行擴增,從而一次反應(yīng)就可以篩選出的退火溫度,優(yōu)化實驗,在節(jié)約成本的同時也節(jié)約了時間。
傳統(tǒng)的梯度PCR儀的加熱模塊由分別控溫的2個Peltier元件組成,對它們設(shè)置不同的溫度,通過熱傳導(dǎo)可形成溫度梯度。不過,由于均勻的金屬加熱模塊兩端設(shè)置的高溫和低溫之間的熱學(xué)相互作用,無法實現(xiàn)真正的線性梯度。實際上,均勻的金屬加熱模塊上的溫度更多呈S形曲線而非線性梯度,列間的溫度差異不一致使其難以確定優(yōu)化后的真實退火溫度,尤其是在優(yōu)化難以處理的試驗時。
Applied Biosystems在這方面就有獨到的設(shè)計,它的VeriFlex加熱模塊有zui多有6個獨立的加熱/冷卻模塊,由溫度控制器單獨控制。各個Peltier模塊之間用隔熱材料進行物理隔離,使得相鄰的Peltier模塊間的溫度干擾zui小化,溫度控制更加。VeriFlex技術(shù)可以在金屬加熱模塊上模擬真正的線性溫度斜率。而且梯度模式和普通模式下升降溫的速率一致,確保優(yōu)化的PCR反應(yīng)條件在隨后的日常運行中也表現(xiàn)出一致的結(jié)果。
研究人員的另一個噩夢是PCR反應(yīng)會蒸發(fā)。這種蒸發(fā)現(xiàn)象使PCR反應(yīng)體系中各組分濃度升高,特別是引物濃度升高,直接導(dǎo)致非特異性擴增。Eppendorf Mastercycler pro 梯度PCR儀則采用vapo.protect技術(shù),防止PCR反應(yīng)體系的蒸發(fā)。vapo.protect 熱蓋利用一塊軟墊覆蓋PCR耗材,各種不同形狀的PCR耗材都能實現(xiàn)覆蓋。這種技術(shù)提高了結(jié)果的重復(fù)性,是小體積擴增的理想之選。Applied Biosystems則是通過熱蓋的自動調(diào)節(jié)和凹形設(shè)計確保PCR管的密封,基本上市場面上常見的PCR耗材都可以使用。當(dāng)然,通常廠家會建議使用Applied Biosystems自己的PCR耗材,畢竟是經(jīng)過廠家多重測試的,肯定也不會錯。
靈活更換
雖說PCR儀已逐漸設(shè)計成個人化的儀器,但真的是實驗室中人手一臺,顯然并不太實際。實驗室中通常有多個課題,每個人的應(yīng)用也各不相同,因此PCR儀能滿足不同的需求。96孔模塊是大多數(shù)人的選擇,但未來有什么樣的需求,當(dāng)下并不清楚。抱著開放的心態(tài),選擇一臺靈活的PCR儀,也許是明智的。
許多PCR儀都允許更換樣品模塊,包括96孔、雙48孔和384孔等。對于有些儀器,各個模塊之間是獨立的,就像多臺PCR儀一樣,可設(shè)置不同的運行程序。比如,Applied Biosystems的ProFlex PCR系統(tǒng)就提供3 x 32孔獨立模塊,允許同時運行3組實驗,每組*獨立,互不干擾。這種設(shè)計提高了效率,讓苦苦等待成為過去。另外,除了標(biāo)準(zhǔn)的96孔模塊,它還提供雙96孔和雙384孔模塊,滿足高通量的測序需要。此外還有雙槽式模塊可供選擇,支持QuantStudio 3D數(shù)字PCR系統(tǒng)使用的芯片
Bio-Rad的C1000 Touch PCR儀也提供4個可互換的模塊,包括96孔、96深孔、48孔和384孔。96深孔模塊可容納0.2或0.5 ml PCR反應(yīng)管,使反應(yīng)體積zui高可達125 μl。這種大的反應(yīng)體積適合新一代測序或芯片的樣品制備。
美好體驗
性能要,操作可得簡單,這也是PCR儀選購時一個重要的考慮因素。畢竟,實驗室里用戶的水平參差不齊,既有經(jīng)驗豐富的老手,也有剛剛?cè)腴T的新手。操作直觀、輕松編程,相信是每個人的愿望。
幸運的是,如今的制造商在設(shè)計時都考慮到這一點,紛紛采用碩大的觸摸屏。有些人可能還不太習(xí)慣,但大多數(shù)人享受著這種隨便點點就能設(shè)置好程序的過程。之前,Veriti PCR儀作為市場上*款觸摸屏PCR儀,在推出時就受到很多客戶的歡迎。斯坦福大學(xué)的博士后Hugo Hilton曾表示:“觸摸屏顯示很直觀,讓用戶對反應(yīng)過程一目了然。"隨后Bio-Rad也相繼推出了C1000和T100觸摸型PCR儀。隨著觸摸屏技術(shù)的快速發(fā)展,越來越靈敏、能快速反應(yīng)的PCR儀也隨之產(chǎn)生,比如Applied Biosystems的ProFlex和SimpliAmp,那感覺和iPad是一樣一樣的。
遠程訪問也增強了用戶體驗,它讓用戶能夠通過智能手機或平板電腦,調(diào)整操作并查看初步結(jié)果。在使用ProFlex PCR系統(tǒng)時,你就能通過免費的My ProFlex手機客戶端,從你的辦公室、會議室、家里,甚至其他任何地方進行遠程連接,查看PCR實驗的運行情況,或查看哪個模塊可以使用。
隨著PCR的應(yīng)用越來越廣泛,人們也希望將PCR儀帶出實驗室,帶到診所和田間。一些制造商也推出了便攜的PCR儀,如Ahram Biosystems。不過,在大多數(shù)情況下,儀器還是擺在擁擠的實驗臺上。而且,一些必要的組件是不可少的,比如加熱元件、電源等。因此,高性能的PCR儀還是占有一定的體積。不過,如今連測序儀都跟U盤一般大了,還有什么是不可能的呢。
過去三十年,PCR已經(jīng)帶給了我們很多的驚喜。未來,儀器性能會更高,操作會更簡便,功能會更多樣,只是,選擇會更困難。擦亮雙眼,看看你真的需要什么,再做決定吧。